JC-1 是一种理想的荧光探针，用于检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential）。当线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体基质（matrix）中形成聚合物，发出红色荧光；而在膜电位较低时，JC-1 无法聚集，以单体形式存在，发出绿色荧光。通过荧光颜色的变化，可以直观地监测线粒体膜电位的动态变化，通常以红绿荧光的相对比例来评估线粒体去极化的程度。线粒体膜电位的降低是细胞凋亡早期的标志性事件。利用JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变，可以简便地检测到细胞膜电位的下降，这一转变亦可作为细胞凋亡早期的可靠指标。JC-1 单体的最大激发波长为514nm，最大发射波长为529nm；而JC-1 聚合物（J-aggregates）的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。在实际观察中，使用常规的红绿荧光观察装置即可满足需求。

线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）（Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1）是一种采用JC-1作为荧光探针，能够快速且灵敏地检测细胞、组织或纯化线粒体膜电位变化的试剂盒。该试剂盒适用于早期细胞凋亡的检测，并以CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照。

产品组成：

操作步骤：

1. 配制JC-1 染色工作液：

取适量JC-1 Stain (200×)，按照每 50μl JC-1 Stain (200×)加入 8ml ddH2O 的比例稀释JC-1，剧烈Vortex 充分溶解并混匀JC-1 Stain。然后再加入 2ml JC-1 Buffer(5×)，混匀后即为 JC-1 染色工作液。6 孔板每孔所需JC- 1 染色工作液的量为 1ml，其它培养器皿的 JC-1 染色工作液的用量以此类推； 对于细胞悬液每 0.5～1.0×106 细胞需 0.5ml JC-1 染色工作液。

2、 设置阳性对照：

推荐CCCP(10mM)按照 1:1000 的比例加入到细胞培养液中，稀释至 10μM，处理细胞 20min。随后按照下述方法装载JC-1，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常 10μM CCCP 处理 20min 后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-1 染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经JC-1 染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞， CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料确定。

3、对于悬浮细胞：

• 取 1～6×105 细胞，重悬于 0.5ml 细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。
• 加入 0.5ml JC-1 染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20min。在孵育期间，按照每 1ml JC-1 Buffer(5×)加入 4ml 蒸馏水的比例，配制适量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。
• 37℃孵育结束后， 4℃ 600g 离心 3～4min，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。
• 用 JC-1 Buffer(1×)洗涤 2 次：加入 1ml JC-1 Buffer(1×)重悬细胞，4℃600g 离心 3～4min，沉淀细胞，弃上清。再加入 1ml JC-1 Buffer(1×)重悬细胞，4℃ 600g 离心 3～4min，沉淀细胞，弃上清。
• 再用少量JC-1 Buffer(1×)重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。
• 4、对于贴壁细胞：
• 注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，应先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
• 吸除 6 孔板培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS 或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入 1ml 细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。
• 加入 1ml JC-1 染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中 37℃孵育 20min。
• 在孵育期间，按照每 1ml JC-1 Buffer(5×)加入 4ml 蒸馏水的比例，配制适量的JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴。
• 37℃孵育结束后，吸除上清，用 JC-1 Buffer(1×)洗涤 2 次。
• 加入 2ml 细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。
• 荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。
• 5、对于纯化的线粒体：
• 把配制好的 JC-1 染色工作液再用JC-1 Buffer(1×)稀释 5 倍。
• 0.9ml JC-1 染色工作液中加入 0.1ml 总蛋白量为 10～100μg 纯化的线粒体。
• 用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描，激发波长为 485nm，发射波长为 590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为 485nm 时，可以在 475～520nm 范围内设置激发波长。另外，也可以参考下面步骤 6 中的波长设置进行荧光检测。
• 用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤 6。

6.荧光观测和结果分析：

检测JC-1 单体时可以把激发光设置为 490nm，发射光设置为 530nm；检测JC-1 聚合物时，可以把激发光设置为 525nm，发射光设置为 590nm。注意：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测JC-1 单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察 GFP 或 FITC 时的设置；检测JC-1 聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或 Cy3 时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。