越来越多的证据表明，腹侧纹状体通过联想学习来运用所获得的信息。本研究观察了清醒活动状态的大鼠在进行进行/不进行气味辨别学习及逆转任务时腹侧纹状体神经元的活动情况。许多神经元会选择性地对预示食欲性（蔗糖）或厌恶型（奎宁）结果的气味线索产生放电反应。在初次接触气味时，只有少数神经元表现出选择性，但随着大鼠逐渐理解气味线索的含义，多数神经元会形成这种差异性活动。其中相当一部分神经元能够编码气味线索经学习获得的动机意义，这些神经元在气味-结果关联发生逆转后，其放电选择性往往也会随之逆转。另一些在学习过程中被选择性激活的神经元则未发生逆转反应，它们似乎主要编码特定气味线索与相应运动反应的组合。研究结果证实，腹侧纹状体能够运用预测性线索经学习获得的食欲性与厌恶型动机意义来指导行为。

一、介绍

当前研究关注腹侧纹状体在联想学习中的作用。特别值得注意的是，腹侧纹状体在运用习得线索（能够预测生物显著性事件发生的刺激）来引导或调节行为方面具有重要作用。电生理记录研究也表明，腹侧纹状体神经元不仅对生物显著性结果本身产生反应，还会对预测这些结果的习得线索作出响应。鉴于历来研究多关注腹侧纹状体在奖赏机制中的作用，大多数研究采用了预测奖赏事件的线索。然而新近证据表明，腹侧纹状体也参与处理厌恶信息及厌恶动机学习。这些发现使人们逐渐认识到腹侧纹状体的功能不仅限于奖励驱动的学习，更广泛参与利用预测生物显著性结果（包括奖赏性与厌恶型）的习得线索。这一功能与研究人员提出的腹侧纹状体作为"边缘运动接口"的概念相吻合，通过该接口，动机显著性信息得以指导行为。然而，对于这类信息在学习过程中如何被编码至腹侧纹状体，尤其是在涉及厌恶事件的情境中，目前了解仍相对有限。

本实验采用我们实验室先前研究基底外侧杏仁核和眶额皮层神经元特性时使用的任务，记录了执行任务大鼠的腹侧纹状体神经活动（图2）。在这项对称强化的进行/不进行气味辨别任务中，缺水大鼠需要学会区分两种气味线索：一种预示奖赏性蔗糖溶液的供给，另一种则预示厌恶型奎宁溶液的供给。本次对腹侧纹状体神经元的研究有三个主要目标：首先是比较腹侧纹状体在处理与食欲性或厌恶型结果相关联线索信息中的作用；其次是探讨腹侧纹状体在学习过程中的作用，通过确定与学习相关的神经关联如何随着气味线索获得意义及行为反应而发展；最后是在相同行为范式下，将腹侧纹状体神经元的编码特性与两个腹侧纹状体传入结构中的观测结果进行关联。尽管基底外侧杏仁核和眶额皮层神经元都能编码关于线索习得动机意义的信息，但它们的编码方式似乎存在差异。我们通过比较腹侧纹状体与这两个结构的编码特性相似性，以期更好地理解这个前脑系统的组成结构如何协同作用来引导目标导向行为。

二、结果

研究人员采用可移动的十根微丝电极束记录腹侧纹状体的神经活动。该电极束在每次记录间隙进行推进，从而在每轮实验中获取新神经元的数据。通过在8只大鼠身上进行的40轮气味辨别学习实验，研究人员记录了腹侧纹状体的神经活动。每轮实验中，口渴的大鼠需要面对由两种新气味构成的辨别任务，以便在新学习过程中获取神经元数据。如图1A所示，电极轨迹位于伏隔核核心区以及紧邻伏隔核背侧的尾壳核腹侧区域。这些位点共记录了256个在执行行为任务时基线放电频率大于0.1赫兹的神经元（平均基线放电频率为2.12赫兹，范围0.1-23.5赫兹）。其中相当大部分神经元（52/256，20%）的基线放电频率（大于3赫兹）处于在纹状体中观察到的快速放电型和紧张性活动中间神经元的典型范围内。考虑到这类神经元在纹状体群体中仅占4%-7%的比例，它们在我们样本中的较高占比可能源于其较大的细胞体积和高放电特性。其余80%基线放电频率低于3赫兹的神经元很可能是在纹状体群体中占主导地位的中型多棘神经元。

图1 腹侧纹状体记录电极轨迹位置及单元分类示例

在每轮实验过程中，大鼠将鼻部探入气味端口（图2）后，会接收到两种气味之一。其中一种积极气味代表位于气味端口下方的液体槽将提供蔗糖溶液，另一种消极气味则代表该液体槽将提供厌恶性的奎宁溶液。在每轮实验中，大鼠最初会对两种气味均进行液体采样（即执行"进行"反应），但随后会逐渐学会在识别消极气味线索后停止反应（即执行"不进行"反应）。在所有实验轮次中，大鼠平均经过96次尝试即可达到预设表现标准（在连续20次尝试中正确反应18次）。

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根据既往研究方法，将达到标准前的实验阶段划分为早期（平均14次尝试）和晚期（平均82次尝试）两个标准前阶段进行分析。大鼠达到标准后平均还进行了84次尝试（标准后阶段）。图3A显示了在早期、晚期及标准后阶段大鼠选择（进行/不进行）准确性的变化情况。如预期所示，在这三个训练阶段中，大鼠的表现呈现显著提升[重复测量方差分析，F(2, 38) = 130.3, p < 0.01]。

图2 实验训练装置及任务行为示意图

图3 气味辨别实验中标准前早期、标准前晚期及标准后阶段的行为表现指标

除了进行与不进行反应的准确性外，研究人员还测量了大鼠在气味采样后到达液体槽的反应潜伏期（不包括执行不进行反应的试验）。如图3B所示，在不同实验阶段（标准前早期、标准前晚期和标准后阶段），反应潜伏期呈现规律性变化：积极气味采样后的潜伏期逐渐缩短，而消极气味采样后的潜伏期则逐渐延长。统计分析显示，实验阶段对积极试验和消极试验的反应潜伏期均存在显著主效应。在训练早期阶段，两种结果对应的反应潜伏期无显著差异，但在标准前晚期和标准后阶段则出现显著差异。值得注意的是，在任何实验阶段中，反应潜伏期差异值与行为准确性之间均未发现显著相关性，这表明二者可能评估的是不同的联想过程。

在气味线索采样过程中，研究人员检测了神经活动是否因关联积极结果与消极结果的线索而异。与先前在投射至腹侧纹状体的脑区研究中观察到的选择性活动一致，本研究发现腹侧纹状体中大量神经元在标准后试验阶段对两种气味线索表现出差异性放电。其中26%的神经元对预测蔗糖的气味线索放电更强，74%则对预测奎宁的气味线索反应更强烈。

在103个于标准后阶段表现出选择性的神经元中，仅有3个在标准前早期就显现出选择性放电，这表明气味线索采样期间的选择性活动与学习过程相关，而非对气味感官特征的编码。为探究这种选择性活动是否编码与气味关联的预期操作反应，研究人员特别分析了那些对消极气味线索反应更强的神经元，比较了大鼠在消极线索采样后执行进行反应与不进行反应时的放电差异。这项仅限于标准后试验的分析显示，仅28%的神经元放电模式受后续操作选择反应影响，表明气味线索选择性活动通常不能归因于对操作反应的预期。后续章节的分析将为这一结论提供更多佐证。

在后续分析中，除非特别说明，对积极与消极气味线索具选择性的神经元数据将合并呈现，因为这两类神经元在放电特性上未见显著差异。例如，两组神经元的基线放电率无统计学差异，在标准前阶段形成选择性放电的比例相近，且在气味-结果关联逆转后发生选择性逆转的比例也相当。

表1 标准后试验阶段对积极/消极线索具选择性的神经元气味线索选择性活动特征 训练任务中的逆转阶段数据

在学习过程中，103个线索选择性神经元中的亚群（46/103，45%）在大鼠达到进行/不进行反应标准之前（即在标准前试验阶段）就发展出了这种选择性。其余57个神经元（55%）仅在标准后试验阶段才产生线索选择性活动。在后续分析中，研究人员分别考察了这两个亚群（分别简称为快速选择性神经元和缓慢选择性神经元）的特性。它们的选择性活动在其他神经特性和行为关联方面表现出系统性差异，提示这些亚群可能编码不同类型的信息。值得注意的是，快速选择性神经元的基线放电频率往往高于缓慢选择性神经元，这意味着前一个亚群中包含更多具有紧张性活动和快速放电神经元特征的高频放电神经元。图4显示了这两个亚群的放电频率分布情况。这两个亚群在簇状放电特性、波形特征或腹侧纹状体内的定位方面均未发现明显差异。

图4 两个气味线索选择性神经元亚群的基线放电频率分布

快速选择性神经元的放电活动主要反映了气味线索经学习获得的动机意义，而非其感官特性或预期的进行/不进行运动反应。根据定义，该亚群神经元在选择行为表现最精准阶段之前就已发展出线索选择性放电（图5），表明这种神经活动与辨别性操作行为并无高度关联。进一步支持该结论的证据来自对标准前晚期试验阶段的行为选择准确性进行分组比较：在此阶段形成气味线索选择性放电的神经元，实际上更多出现在行为选择准确性较差的实验组中（正确率64%，与我们既往观测结果一致），而非出现在准确性更高的实验组（正确率81%）。这一发现表明，在标准前试验阶段发展的线索选择性放电与更高的行为选择准确性并无关联，从而进一步印证了该神经元亚群对气味线索的差异性放电与操作行为表现之间的独立性。

图5 学习过程中气味线索选择性神经活动

为深入探究两个亚群中线索选择性放电发展与行为表现间的关联，研究人员分别分析了神经元产生线索选择性放电的试验序号与大鼠形成正负试验反应潜伏期差异的试验序号，以及与大鼠达到行为表现标准的试验序号之间的相关性。分析结果显示，快速选择性亚群中线索选择性与潜伏期差异出现的试验序号呈接近显著的关联，但其线索选择性与行为标准达成之间未见显著相关性。与之相反，缓慢选择性亚群呈现出完全相反的模式：其线索选择性与潜伏期差异发展间无显著关联，但与行为标准达成时机则表现出显著相关性。这些数据表明，快速选择性亚群的活动与反应潜伏期差异的发展关联更为密切，而缓慢选择性亚群的活动则与辨别性操作反应的发展联系更为紧密。

在部分实验轮次中，研究人员对气味-结果关联进行了逆转操作，使原先预示积极结果的气味转为预示奎宁，原先消极的气味转为预示蔗糖。这些逆转操作在与学习阶段相同的实验轮次中进行，共采集到148个腹侧纹状体神经元在逆转阶段的数据，其中包括60个在逆转前标准后试验阶段已表现出气味选择性的神经元。

这些神经元中仅有极少数在逆转后保持对原气味的放电选择性，这与前述关于气味感官特征编码或原始气味-结果关联信息维持的发现一致。绝大多数神经元在气味-结果关联改变时发生了放电模式的变化（图6）。值得注意的是，前述两个亚群在逆转阶段表现出明显不同的变化模式：快速选择性神经元更倾向于在关联逆转后反转其选择性，而缓慢选择性神经元则更多转变为非选择性状态。这些数据汇总于表2。此外，在逆转前未表现选择性的神经元中，仅极少数在逆转后产生了线索选择性。

图6 气味-结果关联逆转前后的气味线索选择性神经活动

表2 两个气味线索选择性神经元亚群在任务逆转后的活动变化

若气味采样期间的神经活动确实编码了基于奖赏/厌恶结果关联的线索动机意义，那么对特定线索具选择性的神经元理应在结果预期阶段或结果采样阶段也表现出对应选择性。为验证此假设，研究人员检测了这些线索选择性神经元是否在结果预期阶段（完成进行反应后至液体输送前的延迟期）以及蔗糖/奎宁结果采样期间也表现出相应的选择性活动。对延迟期与结果选择性的分析仅针对标准前阶段进行试验展开，因此阶段存在足够多的消极进行试验可供分析。

表3展示了这些分析的结果。相当比例的线索选择性神经元在结果预期或采样期间同样表现出选择性放电，这在延迟期与结果选择性神经元群体中占据重要比重。快速选择性神经元与延迟期/结果选择性的重叠程度最高，而缓慢选择性亚群中的重叠比例未超过随机水平。与整体线索选择性神经元群体情况相似，具有重叠选择性的神经元更频繁地对奎宁结果的预期或采样过程表现选择性。这种对消极结果的优先编码现象在延迟期与结果选择性整体群体中也同样存在（表3）。图7展示了在延迟期及蔗糖/奎宁结果采样期间表现选择性放电的神经元示例。

图7 延迟期及液体结果采样期间的选择性神经活动

表3 气味线索选择性神经元亚群与延迟期/液体结果采样期间选择性放电神经元群的重叠情况

a 重叠程度显著高于随机水平

三、讨论

本实验结果表明，在完成新型进行/不进行气味辨别任务时，腹侧纹状体的神经活动与预测性线索和结果之间的关联学习密切相关。随着大鼠学会辨别，神经元对预示积极或消极结果的气味线索发展出差异性放电。其中一个神经元亚群（快速选择性）似乎最能编码气味线索经学习获得的动机意义，而另一个亚群（缓慢选择性）则主要编码气味线索与预期操作反应的联合表征。这些神经元的联合编码特性支持了腹侧纹状体在利用预测性线索引导行为中的作用。

01.腹侧纹状体神经活动同时编码奖赏性与厌恶型任务事件

结果中一个显著特征是，对预示厌恶性奎宁结果的气味线索具有选择性放电的神经元占主导地位。相当大比例的神经元在奎宁输送前的延迟期及奎宁采样期间也表现出更强的放电活动。尽管多项研究指出腹侧纹状体在对奖赏性与厌恶型结果的比较中显示出奖赏相关编码的优势，但当前研究结果的差异可能源于本任务中对学习过程的要求：在任务中，消极气味对于引导任务习得具有特殊重要性，这种任务需求可能使腹侧纹状体偏向于编码厌恶结果及其预测线索。同时，当前结果也可能反映了奖赏与厌恶事件的相对动机价值差异——即所使用的强厌恶奎宁结果可能比相对稀释的蔗糖具有更强的动机强度。

02.气味线索选择性活动编码线索的习得意义

大部分腹侧纹状体神经元在标准后试验阶段表现出线索选择性活动。通过考察差异性放电在学习过程中如何发展及其受气味-结果关联逆转的影响，本研究区分了与线索习得意义相关的放电和可能涉及感官特征或预期运动反应的放电。分析提示存在两个编码不同类型任务信息的线索选择性神经元亚群：快速选择性神经元亚群编码线索获得的动机意义，其活动与感官编码或预期操作反应无关，且多数能在关联逆转后反转其选择性；缓慢选择性神经元亚群则发展出与辨别性操作反应相关的选择性放电，但其选择性活动主要编码气味线索与操作反应的特定联合表征而非单纯的预期反应。

03.线索选择性神经元亚群：与神经系统及行为的关联

快速选择性亚群的编码特性提示其可能通过反映结果动机意义来调节反应时间。该亚群线索选择性活动的发展与正负线索采样后进行试验中反应潜伏期差异的形成同步。相反，缓慢选择性亚群的编码特性显示其线索选择性放电可能反映了线索意义与运动反应的特定组合，甚至可能是具体的刺激-反应关联。这些神经元的活动可能在利用线索意义引导辨别行为中发挥作用。

这两个亚群的编码特性与大鼠执行相同任务时记录到的两个腹侧纹状体传入结构——基底外侧杏仁核和眶额皮层的特性存在诸多相似之处。快速选择性亚群与基底外侧杏仁核神经元相似，均在标准前阶段发展出线索选择性且多数在逆转后发生选择性反转；缓慢选择性亚群则与眶额皮层神经元特性吻合，主要在标准后阶段形成选择性且逆转后多丧失选择性。这些发现支持腹侧纹状体中存在由不同传入通路激活的神经元集群：快速选择性集群可能接收基底外侧杏仁核输入，强效编码基于结果动机特性的线索习得意义；缓慢选择性集群可能接收眶额皮层输入，编码每个辨别问题中事件的具体联合表征。对这三个结构活动交互作用的深入研究，将有助于理解它们作为整体系统如何利用预测性线索引导行为。

四、实验方法

01.实验对象

八只雄性Long-Evans大鼠作为实验对象，这些大鼠购自查尔斯河实验室，入组时约3月龄。实验期间大鼠单笼饲养，维持24小时光暗周期，除测试前24小时禁水外，均自由获取食物饮水。

02.电极植入与组织学检测

大鼠在手术时体重为300-400克。手术操作流程与此前记录电极植入研究完全相同。大鼠经异氟烷麻醉后固定于立体定位仪，暴露头骨并在记录位点及锚定螺钉对应位置钻孔。将可驱动电极束植入左侧或右侧腹侧纹状体背侧区域，定位坐标为前囟前1.6毫米，旁开1.5毫米，颅骨表面下5.5毫米。电极束由十根直径25微米的铁镍铬合金丝组成（Stablohm 675，California Fine Wire，格罗弗比奇，加利福尼亚州），仅尖端裸露，所有线束均穿经27号薄壁套管。在植入前即刻，用精细手术剪以45度角修剪电极丝使其伸出套管约1毫米，并用电镀铂法（采用六氯铂酸，奥德里奇，密尔沃基，威斯康星州）将阻抗调整至约300千欧。组织学材料检测显示，电极丝在内外侧平面覆盖0.25-0.33毫米区域，在背腹侧平面覆盖0.5毫米区域。

记录过程中每日将电极束推进40微米以获取新神经元信号。最终通过15微安电流持续10秒在电极尖端形成铁沉积标记位点。实验结束后经甲醛和亚铁氰化钾灌注固定，取脑进行组织学处理。

03.行为装置与训练

电生理记录在45厘米见方的铝制实验箱中进行，其内壁向内倾斜使底部面积为30×30厘米。箱体前壁为可向外开启的铰链门。右侧壁装有面板灯，其下方设置气味输送端口和液体槽。天花板安装 commutator 连接数据采集系统，大鼠头部电极通过柔性电缆与 commutator 相连。任务事件与行为数据由基于C++编写的定制程序控制，室内通过白噪声发生器屏蔽环境噪音。

气味辨别任务所使用的气味化合物从国际香精香料公司采购。气味对由差异明显的化合物组成，通过关联结果的效价进行平衡，并确保相似化合物不在连续实验日重复使用。气味载体采用可拆卸式滤芯，通过电磁阀和流量计系统分别向训练箱输送特定气味。所有与气味接触的管路和阀门均专用于单一气味以防止交叉污染。

04.实验流程

试验开始时面板灯亮起，大鼠将鼻部探入气味端口后，预设气味线索会输送至端口后方的半圆柱体空间。大鼠需在气味开始后持续采样250或500毫秒，通过离开端口终止采样。随后3秒内可在端口下方的液体槽执行进行反应。若在积极气味采样后作出反应，经过500-1500毫秒可变延迟后液体槽将提供0.05毫升5%蔗糖溶液；若在消极气味采样后作出反应，则提供等量0.02M奎宁溶液。若3秒内未作出反应则记为不进行反应。消极气味后的进行反应视为错误选择，将触发延长试次间隔。面板灯在试次结束时熄灭。

术后恢复两周，大鼠先接受在气味端口鼻触获取水滴的塑形训练，继而进行单次气味辨别任务训练。当大鼠在连接电缆状态下能稳定完成单次任务习得与逆转后，开始正式记录。每个气味辨别任务由从上述气味库选取的两种气味构成。训练持续至大鼠在连续20次试验中达到18次正确反应的标准。部分实验轮次中，在达到标准后的60-100次试验后进行气味-结果关联逆转操作。

05.数据采集与分析

在每次记录实验中，将大鼠置于训练箱内，在其自由探索时检测电极丝的神经活动信号。若未检测到活动信号，则将大鼠移出并将电极推进40或80微米。若检测到活动信号，则选择活跃电极丝进行记录并开始训练任务。使用Datawave Enhanced Discovery系统采集神经信号，最多可同步记录八个通道的神经波形。来自活跃电极丝的信号经单位增益JFET前置放大器处理，通过300-3000赫兹带通滤波，经Neuralynx系统以5000倍增益进行差分放大（以静息参考电极为基准）。信噪比超过2.5:1的波形以25千赫兹采样率数字化，由数据采集软件连同任务事件时间戳同步存储至硬盘。

使用Plexon公司软件进行离线分析。首先将文件导入Offline Sorter，通过主成分分析和模板匹配算法对各通道波形进行分类。将这些波形与实验期间记录的波形注释进行比对，并检测峰电位间隔直方图以确保峰电位事件间隔大于1毫秒。通常每个活跃通道可分离出1-3个波形，图1B展示了单通道两个单元的分类示例。

随后在Neuroexplorer中处理已分类文件，提取单元时间戳和相关事件标记。使用Matlab统计程序分析这些数据，检测气味采样期间（从气味开始后50毫秒至气味结束后50毫秒）、液体槽反应后可变延迟期间（从反应前50毫秒至液体输送）以及液体输送后（首500毫秒）的放电活动。通过方差分析比较标准前阶段、标准后阶段及逆转阶段中正负试验在这些时间窗内的放电频率。将具有显著活动差异的神经元定义为该时间窗和阶段的"选择性"神经元。基线放电频率通过试次间隔期（从面板灯熄灭至下次试验面板灯亮起）计算。

为探究线索选择性发展与行为变化间的关联，研究人员分析了气味采样期间放电频率差异的发展与反应潜伏期差异及准确选择表现发展的相关性。通过比较每个消极试验（潜伏期分析仅含消极进行试验）的放电频率或反应潜伏期与之前20次试验中所有积极试验的数值，采用Z检验判定消极试验的样本值是否超出积极试验数值的正态分布范围。随后计算首次检测到放电频率显著差异的试验序号与大鼠首次出现反应潜伏期显著增加的试验序号之间的相关系数，同时计算放电频率差异首次出现的试验序号与大鼠达到辨别任务行为标准所需试验序号之间的相关性。采用Fisher's r to z转换评估结果的显著性水平。

在分析不同时间窗选择性活动重叠情况时，使用皮尔逊卡方检验比较具有不同放电特性神经元的比例，并检验两个群体间的重叠程度是否显著高于随机水平。随机水平基于实际表现出各类反应的神经元比例进行计算。例如，若某阶段100个神经元中有50个在积极气味采样期间表现选择性放电，同时同阶段100个神经元中有50个在等待蔗糖输送时表现选择性放电，则随机重叠的预期值为25个神经元。表3中的数据通过分别计算两种效价的重叠比例后相加得出。

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