引言

体内组织的生理功能依赖2D细胞单层与3D细胞球体的空间有序互作，但传统共培养方法（如Transwell、微流控芯片）存在样本用量大、通量低、难以精准定位两种细胞形态的痛点，阻碍了对细胞信号传导、癌症侵袭等复杂生物过程的研究[1-3]。droplet microarray（DMA）平台凭借超微量反应特性，结合I.DOT非接触式纳升级移液技术，为解决这一难题提供了新思路。本研究开发基于DMA的2D/3D细胞共培养方法，通过I.DOT精准控制细胞打印与液滴融合，实现14×14阵列的高通量微型化共培养，两种细胞形态无物理接触但可通过旁分泌信号互作，并成功应用于Wnt信号传导研究，为基础生物学与药物筛选提供了实用且高效的工具。

一、实验方法

1、核心平台与材料设计

采用7.5×2.5 cm DMA芯片，含3个14×14阵列（共588个）1mm×1mm亲水斑点，间距500 μm（超疏水边界分隔，图1a）。选取HepG2、HEK293T、HeLa RFP等细胞，以DMEM为基础培养基；通过“悬滴法”形成3D球体，2D细胞直接贴壁培养；以Wnt-3a分泌细胞（HEK293T-Wnt3a）和Wnt报告细胞（HEK293T-TOP-GFP）验证信号传导功能。

图1.用于二维和三维(分别为2D和3D)细胞培养的并行和组合研究的工程平台。(a)创建2D/3D单元阵列的工作流程示意图。首先，细胞被打印在指定的行中，并孵化一夜，以使细胞形成2D单层。其次，用细胞悬浮液填充剩余的斑点，并以倒置的位置(“悬滴”法)孵育，得到3D细胞球体。最后，将相邻的液滴合并，形成2D和3D单元结构。(b)液滴微阵列(DMA)装置的代表性显微镜图像，该装置在指定行上包含HEK293T球体。(c)DMA的代表性显微镜图像，其中包含分离液滴中的2D和3D细胞培养。第1、3、5、7、9行包含2D培养的HepG2细胞，而第2、4、6、8、10行包含3DHEK293T球体。(d)包含HEK293T细胞的相邻液滴的典型荧光图像，如2D单层(蓝色)和HeLa球体(红色)。(e)典型的荧光图像，显示包含HEK293T细胞的相邻液滴为2D单层(绿色)和HEK293T球体(蓝色)。(f)用蓝色标记的相邻斑点合并的DMA示意图。(g)DMA的显微镜图像，其中合并了包含2D HepG2细胞和3DHEK293T球体的液滴。在一个合并的液滴中具有代表性的3D球体(H)和2D细胞(I)的显微镜图像。

2、实验操作与I.DOT核心应用

2D细胞单层制备：通过I.DOT非接触式纳升级移液系统将200 nL细胞悬液（HepG2，7.5×10⁵ cells/mL，约150个细胞/斑点）精准打印至DMA亲水斑点，正置放入含湿润垫的培养皿（37℃、5%CO₂），培养24h后细胞贴壁形成完整2D单层（图1a；图2a）。I.DOT的纳升级精准分配确保每个斑点细胞密度变异系数<5%，为后续实验重复性奠定基础。

图2. 在DMA上的合并液滴中进行2D单层细胞培养。(a)直位和倒位培养2D单层细胞的工作流程示意图。(b)倒置培养1天、2天和3天后，典型的显微镜图像显示HepG2细胞附着在DMA(上图)上，并在液滴中脱落细胞(下图)。白色箭头显示液滴中的细胞，这些细胞从表面分离。(c)显示在DMA表面倒置培养细胞1-3天后从表面脱落的细胞数量的曲线图(n=50)。(d)单层培养中含有单个和合并的含有HepG2细胞的液滴的DMA显微镜图像。(e)单个亲水点的特写图像，其中包含单层的HepG2细胞，作为合并液滴的一部分。(f)含有2D培养细胞的两个相邻液滴合并的工作流程示意图。(g)在两个相邻液滴合并前、合并后5分钟、24小时和48小时，HeLa细胞在DMA上的存活率。2D，二维；3D，三维；DMA，液滴微阵列。

3D细胞球体构建：先通过I.DOT向DMA斑点打印100 nL抗黏附溶液（减少细胞与DMA芯片表面黏附），室温干燥10min；再打印200 nL的HEK293T悬液（1×10⁶ cells/mL，约200个细胞/斑点），立即倒置芯片并置于定制3D打印支架上，形成“悬滴”（图3a）；重力驱动细胞聚集，培养48h后自发形成直径约200 μm的均一3D球体（图1a；图3b-c）。

图3. 在DMA上的合并液滴中进行3D球体培养。(a)倒置和直立培养3D球体的工作流程示意图。(b)HEK293T细胞在200nL液滴中未涂层斑点形成的细胞团。(c)细胞接种两天后，HEK293T细胞球体在涂有25、50、75和100 nL抗黏附溶液的斑点上形成的典型显微镜图像(左图)。在DMA上培养的球体的典型显微镜图像(n=42)。第四排的红色和绿色圆圈分别代表球体的原始位置和当前位置，表明即使在直位培养3天后，球体也不会附着在表面。(d)饼图，显示每个液滴含有0(不形成球体)、1个、2个和2个以上球体的液滴的百分比。(e)图表，显示成功合并的液滴中含有完整、部分解体、解体和没有球体的液滴的百分比，以及未能合并的液滴的百分比。2D，二维；3D，三维；DMA，液滴微阵列。

液滴融合与共培养：通过I.DOT向相邻的“2D单层斑点”和“3D球体斑点”中各添加900nL新鲜培养基，液滴因体积增加跨越超疏水边界，融合形成含两种细胞形态的单一液滴（总容积约2000nL，图1a；图4d-e）。融合后2D细胞保持贴壁，3D球体悬浮于培养基中，二者无物理接触，仅通过培养基进行旁分泌信号交换。

图4. 控制两个相邻液滴的合并。(a)使用I.DOT分配和合并相邻液滴的示意图。DMA两个相邻亲水点上不同体积的水滴的侧视图。(b)和俯视图(c)，DMA包含1 mm×1 mm的方形亲水斑点，以及500微米的两个斑点边缘之间的超疏水边界。(d)限制在亲水斑点上的单个水滴和合并水滴的示意图。(e)显示不同体积的液滴的表观水接触角(θa)的曲线图，范围从100至1100 nL(n=10)。液滴微阵列。

检测与分析：通过荧光显微镜（Keyence BZ-X800）观察细胞形态；Hoechst 33342（总细胞）与PI（死细胞）染色评估活力（I.DOT打印50 nL染色液至每个斑点，孵育15min）；Wnt信号实验中，通过confocal显微镜（Zeiss LSM800）采集GFP荧光图像，ImageJ量化荧光积分密度（定义为：平均荧光强度×细胞/球体面积），统计信号激活效率。

二、实验结果

1、I.DOT保障2D/3D细胞形态稳定性

2D单层完整性：I.DOT打印的HepG2细胞正置培养24h形成致密单层，即使倒置“悬滴”培养3天，仅1.5±0.3个细胞/斑点脱落（占总细胞数的1%，图2b-c）；液滴融合后，2D单层无破损，细胞活力维持在94.2%±2.1%（图2g），证明I.DOT的打印与融合操作对细胞损伤极小。

3D球体均一性：经I.DOT打印100 nL抗黏附溶液后，92.99%的DMA斑点可形成单个3D球体（图3d），球体圆形度>0.9，直径变异系数<8%；正置培养3天内，球体无贴壁或解体，仅体积轻微增加5.2%（图3c）；液滴融合后，仅0.8%的球体出现破损（图3e），验证了3D形态的稳定性。

2、I.DOT精准调控液滴融合阈值

I.DOT打印的200 nL液滴在亲水斑点上稳定存在（接触角38°±4°，图4e），当向相邻斑点添加培养基至总容积达1100 nL时，液滴自发跨越超疏水边界融合，形成接触角85°±1°的稳定大液滴（图4b-e）；融合过程耗时仅110s/20组，且24h内无蒸发或渗漏（体积变化<3%），证明I.DOT可通过体积精准控制实现高通量液滴融合。

3、Wnt 信号双向传导：共培养体系的功能验证

3D→2D信号传导：I.DOT构建“Wnt-3a分泌球体（3D）+报告细胞单层（2D）”共培养模型，融合后72h，报告细胞GFP荧光积分密度达297.1±91.0，是无Wnt-3a对照组（35.7±14.5）的8.3倍（图5b-c），且荧光均匀分布于2D单层，证明信号从3D球体高效传递至2D细胞。

2D→3D信号传导：反向构建“Wnt-3a分泌单层（2D）+报告球体（3D）”模型，融合后72h，报告球体GFP荧光积分密度达605.5±214.8，是对照组（68.2±35.7）的8.9倍（图5f-g），且球体内部细胞均激活GFP，验证了信号传导的双向性与完整性。

图5. Wnt-3a在2D/3D细胞阵列中的旁分泌传播和Wnt信号的激活。(a)顶端绿色荧光蛋白(GFP)荧光报告细胞在2D单层中与WNT-3a产生细胞球体共培养的工作流程示意图。(b)共培养24、48、72小时后2D报告细胞积分密度的曲线图。积分密度定义为平均绿色荧光蛋白荧光强度与细胞面积的乘积(n=30，*p<；0.001，单因素方差分析)。GFP激活的典型荧光图像。(c)和对照实验(不含WNT-3a)；(d),(e)WNT-3a产生细胞在2D单层和TOP-GFP报告细胞中培养为球体的共培养工作流程示意图。(f)显示共培养24、48和72小时后3D报告球体的综合密度的曲线图。积分密度定义为平均绿色荧光蛋白荧光强度与球体面积的乘积(n=10，*p<；0.001，单因素方差)。GFP激活的典型荧光图像。(g)和对照分析(在没有WNT-3a的情况下)。(h) 2D，二维；3D，三维；DMA，液滴微阵列。

三、总结与讨论

本研究基于DMA平台开发的2D/3D细胞共培养体系，通过I.DOT非接触式纳升级移液技术实现了三大核心突破：首先是精准性革新，I.DOT解决了传统共培养“细胞定位难、体积误差大”的痛点，可实现“200 nL细胞悬液-100 nL抗黏附溶液-900 nL融合培养基”的均一操作，使2D细胞单层脱落率<1%、3D细胞球体单球率>92%，为旁分泌信号研究提供了稳定的微型化模型；其次是高通量与功能兼容，单块DMA芯片含588个独立斑点，可同步开展数百组共培养实验（通量为Transwell的6倍），且体系兼容荧光成像、活力检测与信号量化，成功解析了Wnt信号在2D与3D细胞间的双向传导，填补了“体外模拟体内细胞互作”的技术空白。

未来，I.DOT不仅可用于细胞信号传导研究，还可拓展至癌症侵袭（肿瘤球体与基质细胞共培养）、药物筛选（评估药物对2D/3D细胞互作的影响）、胚胎发育模拟（多细胞形态空间互作）等领域，结合I.DOT的自动化特性，可实现共培养实验的规模化开展，为基础生物学研究与转化医学提供“接近体内微环境”的高效工具；而I.DOT与DMA的协同，不仅重新定义了2D/3D细胞共培养的实现路径，更推动了“超微量、高通量、功能化”细胞互作研究的发展，为解析复杂生物机制提供了全新技术范式。